Mouse Liver Ductal Organoid Kit Plus (Differentiation)

小鼠肝膽管類器官培養(yǎng)基套裝Plus（分化）

1、 產(chǎn)品描述

模基生物小鼠肝膽管類器官培養(yǎng)基套裝Plus（分化）【Mouse Liver Ductal Organoid Kit Plus (Differentiation)】是一種化學(xué)定義的細(xì)胞培養(yǎng)基，用于建立和培養(yǎng)從成體干細(xì)胞衍生的小鼠肝膽管類器官。肝膽管的自我更新上皮細(xì)胞是由位于肝臟的干細(xì)胞及其祖細(xì)胞的擴(kuò)增所驅(qū)動的。肝膽管類器官因其上皮在結(jié)構(gòu)、細(xì)胞類型組成和自我更新動力學(xué)方面的表現(xiàn)，而具有真實(shí)器官的特征。肝膽管類器官可以在分化培養(yǎng)基中誘導(dǎo)出肝樣細(xì)胞，為小鼠類肝臟發(fā)育和疾病的研究提供了的模型。

2、 產(chǎn)品信息

3、 其他自備材料和試劑

4、 小鼠肝膽管類器官培養(yǎng)基（分化）的使用說明

1、   收到類器官培養(yǎng)基后，將培養(yǎng)基置于4℃冰箱進(jìn)行解凍。

2、   待培養(yǎng)基解凍后上下顛倒充分混勻，在生物安全柜或潔凈工作臺中根據(jù)日常需求量進(jìn)行分裝，推薦類器官培養(yǎng)基分裝成10mL/管，培養(yǎng)因子B分裝為40μL/管；

3、   分裝后的培養(yǎng)基請密封后儲存于-20℃，使用時取出分裝的培養(yǎng)基放置室溫平衡后即可使用。

5、 小鼠肝膽管類器官分化培養(yǎng)

注意：小鼠肝膽管類器官分化培養(yǎng)前需要經(jīng)過傳代擴(kuò)增培養(yǎng)3天后進(jìn)行

a)     原代小鼠肝膽管類器官的建立

1、   實(shí)驗(yàn)前先將基質(zhì)膠放置4℃冰上解凍，同時取出培養(yǎng)基放置室溫平衡。與細(xì)胞接觸的離心管、試管或者塑料吸頭需要用類器官培養(yǎng)防粘附潤洗液潤洗后使用。

2、   取樣：小鼠斷頸處死，表面噴灑酒精殺菌。在無菌條件下取出小鼠肝臟組織，放入4℃預(yù)冷的上皮類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基或含雙抗的DPBS中，清洗組織2次。

3、   使用鑷子將組織轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，在冰上用無菌的將碎為0.5~2mm2大?。軌蛲ㄟ^10mL移液管的）。

注：以下操作與細(xì)胞接觸的耗材均需用潤洗液潤洗后使用：

4、   用預(yù)冷的上皮類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸樣本轉(zhuǎn)移15mL離心管中，補(bǔ)充預(yù)冷的上皮類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基至10mL。

5、   用10mL移液器上下吹打至少10次，清洗組織。靜止1分鐘，待組織自然沉降至離心管底部，小心吸棄上清，重復(fù)清洗組織3次。

6、   將清洗后的組織用50倍組織體積的重懸，吹打重懸組織塊。于37℃，100rpm條件下的恒溫?fù)u床中，水平振蕩消化30分鐘，每隔10分鐘觀察組織消化情況，待組織塊明顯分散，懸液較渾濁時，取適量組織消化懸液鏡檢，待懸液中有較多膽管結(jié)構(gòu)即可終止消化，若組織碎塊較大或消化不可適當(dāng)延長消化時間。消化期間可以使用不同規(guī)格（順序從大到小如10mL、5mL、1mL）的移液管吹打組織消化懸液，幫助充分消化。當(dāng)大多數(shù)組織片段能夠通過1mL移液器吸頭時，消化過程即完成。

7、   將FBS加入組織消化混合物中，最終濃度為2%，使用移液器反復(fù)吹打20次，靜止2分鐘后，收集上清，4℃下以250g離心3分鐘。

8、   在可見的紅色沉淀的情況下，吸棄上清液，加入2mL紅細(xì)胞裂解液重懸沉淀，在室溫下裂解紅細(xì)胞1分鐘，并在4℃下以250g離心3分鐘。

9、   吸棄上清液并將沉淀重懸于上皮類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，在4℃下以250g離心3分鐘，再次重復(fù)此步驟以去除消化液和FBS，在離心前可取適量的懸液進(jìn)行細(xì)胞活性檢測。

10、 吸棄上清液，根據(jù)培養(yǎng)需求取適量細(xì)胞沉淀加入基質(zhì)膠（>70%）并在冰上混勻。注：基質(zhì)膠應(yīng)保存在冰上以防止其凝固。盡快進(jìn)行該過程。大約10,000個細(xì)胞應(yīng)接種在25μL基質(zhì)膠中或50個管狀結(jié)構(gòu)接種在25μL基質(zhì)膠中。不要過度稀釋基質(zhì)膠（基質(zhì)膠比例應(yīng)>70%（基質(zhì)膠體積/總體積）），因?yàn)檫@可能會抑制固體液滴的正確形成。

11、 將基質(zhì)膠和細(xì)胞的混合懸液點(diǎn)入培養(yǎng)孔板底部正，使用槍頭稍微攤平懸液，注意避免懸液接觸孔板側(cè)壁。（推薦：96孔板接種3~10μL/孔，48孔板接種10~20μL/孔，24孔板接種20~30μL/孔）。

注意：一旦類器官重懸于基質(zhì)膠中，盡快進(jìn)行種板，因?yàn)榛|(zhì)膠可能會在試管或移液器吸頭中凝固。

12、 將培養(yǎng)板放入37℃和5%CO₂的培養(yǎng)箱中15-25分鐘，讓基質(zhì)膠凝固。

13、 待基質(zhì)膠凝固后，沿壁緩慢加入室溫平衡的小鼠肝膽管類器官擴(kuò)增培養(yǎng)基（MA-0817H009HSP），避免破壞已凝固結(jié)構(gòu)。（推薦：96孔板加入100μL/孔，48孔板加入250μL/孔，24孔板加入500μL/孔）。

注：不要將培養(yǎng)基直接添加到基質(zhì)膠液滴的頂部，因?yàn)檫@可能會破壞已凝固結(jié)構(gòu)。

14、 將培養(yǎng)板置于37℃和5%CO₂的恒溫培養(yǎng)箱中。

15、 每隔2~3天更換一次培養(yǎng)基，小心地從孔中吸出培養(yǎng)基，并加入新鮮的室溫平衡的小鼠肝膽管類器官擴(kuò)增培養(yǎng)基（MA-0817H009HSP）。

16、 密切監(jiān)測類器官生長狀態(tài)，理想情況下，小鼠肝膽管類器官應(yīng)在7-14天內(nèi)建成。

b)      鼠肝膽管類器官的分化培養(yǎng)

1、   待類器官培養(yǎng)到直徑為500μm大小時（或變黑不再增大時），即可進(jìn)行類器官的傳代（每代約1~2周）。以下操作與細(xì)胞接觸的耗材均需用潤洗液潤洗后使用。

2、   吸棄舊培養(yǎng)基，加入等體積上皮類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基，用細(xì)胞刮刀或者移液管吸頭輕輕刮下（或吹打）基質(zhì)膠和類器官混合物，轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中（每管最多收集2~3孔類器官，避免體積體積過大消化效率低），吹打5~10次，使類器官和基質(zhì)膠分離，300g離心3分鐘。

3、   去除上清液加入5倍于基質(zhì)膠和類器官混合物體積的類器官消化液，吹打混勻后置于37℃培養(yǎng)箱中消化5~10分鐘。取出吹打混勻，取10μL混合液鏡檢是否消化成小的細(xì)胞團(tuán)塊，消化不充分可適當(dāng)延長消化時間。密切監(jiān)視消化過程使在類器官解離液中的孵育時間最短。

4、   消化完成后，加入5倍體積上皮類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基吹打混勻以終止消化反應(yīng)，然后250g離心3分鐘。

5、   吸棄上清液，用上皮類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基清洗2次以去除殘留的消化液。次清洗可將類器官合并收集在同一個離心管中。

6、   清洗完成后將離心沉淀中的細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，在細(xì)胞沉淀中加入基質(zhì)膠（>70%）并在冰上混勻（注意，混勻吹打的動作要輕柔，切忌產(chǎn)生大量氣泡，常溫混勻則需要控制在15秒內(nèi)），混勻后置于冰上。注意：基質(zhì)膠稀釋比例應(yīng)在70%以上以保證培養(yǎng)過程中基質(zhì)膠的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。

7、   將基質(zhì)膠和細(xì)胞的混合懸液點(diǎn)入培養(yǎng)孔板底部正，使用槍頭稍微攤平懸液，注意避免懸液接觸孔板側(cè)壁。（推薦：96孔板接種3~10μL/孔，48孔板接種10~20μL/孔，24孔板接種20~30μL/孔）。注意：為防止基質(zhì)膠室溫凝固，此步驟應(yīng)盡快完成。

8、   將培養(yǎng)板放入37℃和5%CO₂的培養(yǎng)箱中15-25分鐘，讓基質(zhì)膠凝固。

9、   待基質(zhì)膠凝固后，沿壁緩慢加入室溫平衡的小鼠肝膽管類器官擴(kuò)增培養(yǎng)基（MA-0817H009HSP），避免破壞已凝固結(jié)構(gòu)。（推薦：96孔板加入100μL/孔，48孔板加入250μL/孔，24孔板加入500μL/孔）。

注：不要將培養(yǎng)基直接添加到基質(zhì)膠液滴的頂部，因?yàn)檫@可能會破壞已凝固結(jié)構(gòu)。

10、 將培養(yǎng)板置于37℃和5%CO₂的恒溫培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)3天后，小心地從孔中吸出培養(yǎng)基，并加入新鮮的室溫平衡小鼠肝膽管類器官分化培養(yǎng)基（不添加培養(yǎng)因子B），每天更換一次培養(yǎng)基。

11、 使用小鼠肝膽管類器官分化培養(yǎng)基培養(yǎng)9天后，按照培養(yǎng)因子B標(biāo)簽上的稀釋倍數(shù)配制含培養(yǎng)因子B的小鼠肝膽管分化培養(yǎng)基（例如：取10mL小鼠肝膽管分化培養(yǎng)基添加40μL培養(yǎng)因子B（250X），使用該培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)小鼠肝膽管類器官3天，期間需要每天更換一次含培養(yǎng)因子B的小鼠肝膽管分化培養(yǎng)基。）

V2.0版

更新時間：2025/6/17