今天想給大家介紹另一種分泌型細胞因子的檢測方法，也就是ELISPOT技術，它是目前用于細胞因子檢測靈敏的實驗方法。

01

Enzyme-linked Immunospot Assay，即ELISPOT，全名為酶聯(lián)免疫斑點檢測。該技術同時結(jié)合了細胞培養(yǎng)技術和酶聯(lián)免疫吸附技術（ELISA技術），能夠在單細胞水平檢測細胞因子的分泌情況（ELISPOT實際上是雙夾心ELISA的延伸和發(fā)展，可以看作單細胞水平的ELISA）。該技術的優(yōu)點在于：①靈敏度高，較傳統(tǒng)ELISA靈敏度高2-3個數(shù)量級；②單細胞水平評價活細胞功能；③操作簡單，可進行高通量篩選。

ELISPOT常見的應用領域包括：T/B細胞功能研究、自身免疫檢測、yizhi、疫苗和藥品的研發(fā)與檢測、腫瘤研究、傳染病的研究和檢測、病毒研究等。ELISPOT技術最初用于B淋巴細胞分泌抗體的檢測。由于B細胞分泌的抗體量一般較大，容易檢測，即使早期ELISPOT檢測靈敏度不高，但是用于抗體檢測還是綽綽有余。后面隨著技術的進步，ELISPOT檢測的靈敏度越來越高，因此被更多地用于痕量細胞因子的檢測。ELISPOT用于T細胞功能評價時，能夠區(qū)分活化的T細胞亞群，例如，Th1細胞產(chǎn)生IFN-γ、IL-2和TNF-α，Th2細胞產(chǎn)生IL-4、IL-5和IL-13等。目前利用ELISPOT檢測T細胞分泌IFN-γ的實驗已經(jīng)得到非常廣泛的應用，尤其在疫苗有效性評價中具有重要意義，原因：① IFN-γ與CD8 T細胞的溶細胞活性密切相關；② CD4 T細胞參與的細胞毒性免疫反應會產(chǎn)生IFN-γ。

02

ELISPOT實驗原理

ELISPOT實驗原理如圖1：

a：ELISPOT 實驗在96孔板上進行，使用 PVDF 膜作為基質(zhì)，膜上包被特異性的單克隆抗體（抗體須無毒，不含內(nèi)毒素，親和力高），以捕獲細胞分泌的細胞因子。

b：待測細胞和刺激物（抗原或絲裂原）在板內(nèi)進行共培養(yǎng)，此時待測細胞分泌的細胞因子能夠被包被在膜上的抗體特異性地捕獲。

c：去除細胞后，加入生物素標記的二抗，可與被捕獲的細胞因子相結(jié)合。

d：然后加入酶標親和素與生物素結(jié)合，進行化學酶聯(lián)顯色反應，此時可以在膜的局部形成一個個圓形斑點e，一個斑點對應當初一個分泌細胞因子的細胞。

e：特異性抗原再刺激引流淋巴結(jié)細胞9天進行小鼠IFN-γ ELISPOT檢測結(jié)果。

陽性細胞率%=膜斑點數(shù)/加入孔內(nèi)的細胞總數(shù)×100%

圖1 ELISPOT技術檢測原理[1]

注：也可以直接使用熒光素標記二抗與細胞因子進行結(jié)合反應，此時不再需要進行化學發(fā)光顯色，可以一次檢測多種細胞因子。但是作為膜板材質(zhì)的NC膜和PVDF膜具有自發(fā)熒光的問題，會造成檢測結(jié)果背景升高。

實驗所使用的的配對抗體對于斑點形成的靈敏度具有重要影響，以下兩圖列出了小鼠和人進行細胞因子ELISPOT實驗文獻中推薦使用的配對抗體?？贵w可以從多種商業(yè)途徑獲得，包括eBiosciences、Biolegend、BD Biosciences和Thermo Scientific等。

圖2 小鼠細胞因子ELISPOT實驗推薦使用的配對抗體[1]

圖3 人細胞因子ELISPOT實驗推薦使用的配對抗體[1]

以下過程1（抗原包被）和2（細胞培養(yǎng)）必須在無菌條件下進行，過程3（細胞因子檢測）在常規(guī)條件下操作即可。我們也可以用ELISPOT實驗檢測分泌特異性抗體的B細胞，該過程的原理和步驟與細胞因子ELISPOT測定相同，不同之處在于需要使用特異性抗原（例如肽或蛋白質(zhì)，1-20 μg/mL）而非抗體包被ELISPOT板。

（1）準備無菌的96孔PVDF膜ELISPOT板，每孔加入50 μL 70%的乙醇溶液，室溫孵育30 s。

注：在PVDF膜之前，經(jīng)常使用的是硝酸纖維素膜。大家都知道PVDF膜和NC膜是我們進行WB實驗常用的兩種蛋白結(jié)合膜，其中PVDF膜比NC膜具有更優(yōu)的蛋白吸附性能，更精細的顯色條帶分辨率。但是由于疏水性問題，PVDF膜使用前常需要用酒精活化，增強其蛋白結(jié)合能力（潤濕后PVDF膜由潔白不透明變成暗色半透明狀）。

（2）棄乙醇溶液，每孔以200 μL無菌PBS洗滌3次，盡量減少乙醇殘留。

注：本實驗所用的所有PBS溶液均不含鈣、鎂離子。在進行移液操作時，移液槍應沿著孔壁接近孔底的地方加入，不能直接對著膜垂直加入或者觸碰到膜，減少膜可能的破損。此外，若在高壓/高速下往孔中添加或移除溶液，可能導致孔的背景顏色不均勻。因此后面在洗滌膜板時，通常是將膜板浸入水中而不是直接利用流動的水進行沖洗。

（3）96孔板每孔加入抗體溶液50 μL（無菌PBS稀釋至適宜濃度），蓋上板蓋置于濕盒中（可減少抗體溶液揮發(fā)），4℃包被過夜。

注：內(nèi)毒素對ELISPOT實驗的結(jié)果會產(chǎn)生很大的影響，即使是微量的內(nèi)毒素也能非特異性刺激T淋巴細胞，促進細胞因子的分泌。實驗中內(nèi)毒素的來源主要是各種試劑。此外，血清除了含有內(nèi)毒素之外還可能含有其它未知的ELISPOT敏感性成分，影響最終斑點的形成，使用無血清ELISPOT技術可以避免其影響。文獻[1]在培養(yǎng)小鼠細胞時使用的是HL-1培養(yǎng)基，培養(yǎng)人細胞時使用的是CTL-Test培養(yǎng)基。

以下過程1（抗原包被）和2（細胞培養(yǎng)）必須在無菌條件下進行，過程3（細胞因子檢測）在常規(guī)條件下操作即可。我們也可以用ELISPOT實驗檢測分泌特異性抗體的B細胞，該過程的原理和步驟與細胞因子ELISPOT測定相同，不同之處在于需要使用特異性抗原（例如肽或蛋白質(zhì)，1-20 μg/mL）而非抗體包被ELISPOT板。

（1）準備無菌的96孔PVDF膜ELISPOT板，每孔加入50 μL 70%的乙醇溶液，室溫孵育30 s。

注：在PVDF膜之前，經(jīng)常使用的是硝酸纖維素膜。大家都知道PVDF膜和NC膜是我們進行WB實驗常用的兩種蛋白結(jié)合膜，其中PVDF膜比NC膜具有更優(yōu)的蛋白吸附性能，更精細的顯色條帶分辨率。但是由于疏水性問題，PVDF膜使用前常需要用酒精活化，增強其蛋白結(jié)合能力（潤濕后PVDF膜由潔白不透明變成暗色半透明狀）。

（2）棄乙醇溶液，每孔以200 μL無菌PBS洗滌3次，盡量減少乙醇殘留。

注：本實驗所用的所有PBS溶液均不含鈣、鎂離子。在進行移液操作時，移液槍應沿著孔壁接近孔底的地方加入，不能直接對著膜垂直加入或者觸碰到膜，減少膜可能的破損。此外，若在高壓/高速下往孔中添加或移除溶液，可能導致孔的背景顏色不均勻。因此后面在洗滌膜板時，通常是將膜板浸入水中而不是直接利用流動的水進行沖洗。

（3）96孔板每孔加入抗體溶液50 μL（無菌PBS稀釋至適宜濃度），蓋上板蓋置于濕盒中（可減少抗體溶液揮發(fā)），4℃包被過夜。

注：內(nèi)毒素對ELISPOT實驗的結(jié)果會產(chǎn)生很大的影響，即使是微量的內(nèi)毒素也能非特異性刺激T淋巴細胞，促進細胞因子的分泌。實驗中內(nèi)毒素的來源主要是各種試劑。此外，血清除了含有內(nèi)毒素之外還可能含有其它未知的ELISPOT敏感性成分，影響最終斑點的形成，使用無血清ELISPOT技術可以避免其影響。文獻[1]在培養(yǎng)小鼠細胞時使用的是HL-1培養(yǎng)基，培養(yǎng)人細胞時使用的是CTL-Test培養(yǎng)基。

圖4 ELISPOT實驗過程總覽[2]

（3）棄去封閉液，每孔以200 μL無菌PBS洗滌1次，輕輕在無菌吸水紙上扣干。（膜板不用時可在4℃保存數(shù)周）

注：后續(xù)若是使用的是過往封閉的膜板，每孔可以加入200 μL細胞培養(yǎng)基于室溫下靜置10 min。棄培養(yǎng)基后，重復該操作一次，再棄培養(yǎng)基，扣干后進行后續(xù)實驗操作。

（4）組別設計：① 陰性對照孔：100 μL培養(yǎng)基+100 μL細胞；② 細胞樣品孔：100 μL培養(yǎng)基稀釋的適宜濃度刺激物+100 μL細胞；③ 陽性對照：100 μL陽性對照刺激物+100 μL細胞（常用陽性對照刺激物類型及濃度見文末附1和2）；④背景對照孔：不含細胞，只加培養(yǎng)基和所有的檢測試劑。

注1：細胞加入之后，不宜再震動或拍擊ELISPOT板，震動或拍擊反而會促進細胞成圈分布在孔的外周。同時ELISPOT板之間不能疊放，疊放會引起整塊板溫度不均勻，導致四周溫度較高的邊緣效應。

注2：細胞狀態(tài)對ELISPOT檢測結(jié)果具有重要意義。細胞狀態(tài)好、活力高、功能保持完整，那么檢測獲得的結(jié)果必然好。因此在進行ELISPOT檢測時要盡可能保證細胞處于良好的生長狀態(tài)。對于新鮮分離的原代細胞，需要盡可能減少分離過程中的機械損傷以及有毒化學物質(zhì)對細胞的損害。對于凍存后復蘇的細胞，通常較難保證細胞的生長狀態(tài)，因此對細胞凍存過程提出了更嚴格的要求。

（1）棄去孔內(nèi)的混合培養(yǎng)液，每孔加入200 μL冰冷的去離子水，在冰浴上孵育10 min。孵育結(jié)束后，每孔用200 μL PBST（含0.05%Tween的PBS溶液）溶液洗滌5次，以除去細胞和未結(jié)合的細胞因子。最后一次棄去液體后，輕輕在吸水紙上扣干。

（3）孵育結(jié)束后，每孔以200 μL PBST溶液洗滌5次，洗滌最后一次時，將PVDF膜板背面的塑料保護層取下，同時洗滌膜的正反兩面，蓋上保護層，輕輕在吸水紙上扣干。

（5）酶底物顯色：每孔加入200 μLPBST溶液洗滌5次，洗滌最后一次時，將PVDF膜板背面的塑料保護層取下，同時洗滌膜的正反兩面，蓋上保護層，輕輕在吸水紙上扣干。隨后每孔加入100 μL BCIP/ NBT（用于ALP）或100 μL AEC（用于HRP）顯色液，用鋁箔覆蓋膜板避光。

（6）待斑點生長到合適大小，以去離子水洗滌2次，終止顯色反應。將板倒扣在吸水紙上，拍干細小的水珠，之后取下保護層，放在通風的地方，室溫靜置10-30 min，讓膜自然晾干。

（7）將ELISPOT板置于自動讀板儀內(nèi)，調(diào)節(jié)好合適的參數(shù)后，進行斑點計數(shù)并作統(tǒng)計分析[3]。

注：斑點計數(shù)時，應注意區(qū)分由纖維、膜撕裂、碎片等導致的不規(guī)則斑點，一般細胞生成的斑點通常為圓形。

附1：實驗所用的刺激物（抗原）類型[4]：

① Freeze and Thaw lysate（細胞凍融產(chǎn)物）

② Class I and Ⅱ Peptides（I類和Ⅱ類肽）

③ Recombinant proteins（重組蛋白）

④ RNA

圖注：來自免疫小鼠脾細胞的IFN-γ+斑點形成細胞。C57BL/6小鼠在第0天和第21天單獨用OVA（10 μg）或聯(lián)合明礬（40 μg）+ CpG 1826（10 μg）佐劑進行肌肉注射誘導免疫反應。在第28天收集脾細胞，用IFN-γ ELISpot分析OVA特異性CD4 T細胞。代表性結(jié)果如圖a-d。a, b：經(jīng)OVA免疫后分離的小鼠細胞在板中分別用培養(yǎng)基或2 μg/mL ISQAVHAAHAEINEAGR（CD4 Epitope）進行刺激。c, d：經(jīng)OVA+明礬/CpG聯(lián)合免疫后分離的小鼠細胞在板中分別用培養(yǎng)基或2 μg/mL ISQAVHAAHAEINEAGR進行刺激。

04

ELISPOT評價T細胞功能注意事項

在前面的實驗步驟中，我已經(jīng)盡可能羅列了各步操作中應當注意的事項，在此根據(jù)文獻[5]對相關內(nèi)容再做補充，希望幫助大家拿下這個實驗。

（7）每孔細胞數(shù)：如果抗原特異性T細胞頻率未知，推薦以3-5×10⁵細胞/孔作為起始數(shù)目。在1-8×10⁵細胞/孔的范圍內(nèi)，加入的細胞數(shù)與形成的斑點數(shù)具有良好的線性關系，實際可根據(jù)需求進行調(diào)整。此外，由于臨床樣本的珍貴性，PBMC以10⁵細胞/孔設置多個復孔，可以幫助獲得較準確的結(jié)果。

注：如有必要，可通過滴定來確定ELISPOT實驗所使用的細胞密度，以獲得特定組織類型來源細胞的最佳斑點分離效果。文獻[1]給出了一些常見細胞的推薦使用濃度。在使用純化的T淋巴細胞或者每孔細胞數(shù)少于10⁶時，推薦在活化期間加入額外的飼養(yǎng)層細胞（比如脾細胞）或抗原提呈細胞（APC），前提是確保加入這些細胞有效。特定組織每孔細胞常用濃度為：

⑨人APCs：自體PBMCs 0.5×10⁶細胞/孔

（9）DMSO濃度控制：大多數(shù)I類MHC限制性肽是疏水性的，需要用DMSO助溶，超過0.5%濃度的DMSO對淋巴細胞，尤其是活化的淋巴細胞有毒。