貝類5羥色胺(5-HT)ELISA試劑盒操作注意事項(xiàng)
在完成試劑配制和樣本預(yù)處理后,需特別注意以下操作細(xì)節(jié)以確保檢測(cè)準(zhǔn)確性:
1. 加樣標(biāo)準(zhǔn)化
使用多通道移液器時(shí),建議提前校準(zhǔn)移液頭精度,每孔加樣量誤差需控制在±2%以內(nèi)。對(duì)于高黏度貝類組織勻漿,建議采用反向吸液法,并在加樣前用預(yù)冷PBS潤(rùn)洗槍頭3次,避免樣本掛壁導(dǎo)致的體積偏差。
2. 溫育環(huán)境控制
37℃孵育階段應(yīng)使用具有主動(dòng)循環(huán)功能的恒溫箱,并在反應(yīng)板表面覆蓋密封膜時(shí)預(yù)留5mm透氣邊縫,防止冷凝水積聚。每30分鐘人工搖板1次(振幅10cm,頻率60次/分鐘),可顯著提高抗原抗體結(jié)合效率。
3. 洗板關(guān)鍵參數(shù)
自動(dòng)洗板機(jī)建議設(shè)置"預(yù)洗-浸泡-終洗"三步程序:預(yù)洗液量300μL/孔(流速1mL/s),Tris緩沖液浸泡60秒,終洗采用脈沖式?jīng)_洗(5次×200μL/次)。手工洗板時(shí)需保持洗液注滿板孔后靜置90秒,棄液時(shí)板體傾斜45°角輕叩10次。
?4. 顯色終止時(shí)機(jī)
當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品最高濃度孔OD值達(dá)到0.8-1.2時(shí)(波長(zhǎng)450nm),應(yīng)立即終止反應(yīng)。對(duì)于富含黑色素的貽貝樣本,建議在終止后30分鐘內(nèi)完成讀數(shù),并使用620nm參比波長(zhǎng)校正濁度干擾。
5. 數(shù)據(jù)質(zhì)控要點(diǎn)
每批次應(yīng)包含3個(gè)質(zhì)控樣本:空白對(duì)照(零標(biāo)準(zhǔn)品)、基質(zhì)加標(biāo)回收樣(80-120%回收率)、重復(fù)樣(CV值<8%)。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)曲線R2值<0.99時(shí),需復(fù)核標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋步驟是否出現(xiàn)跳管污染。
特殊情況下(如檢測(cè)扇貝生殖腺樣本),可適當(dāng)調(diào)整樣本稀釋倍數(shù)至1:5,并延長(zhǎng)封閉時(shí)間至45分鐘。所有操作需在避光環(huán)境下完成,避免5-HT光降解。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,剩余96孔板條應(yīng)立即裝入含干燥劑的鋁箔袋,4℃保存不超過(guò)72小時(shí)。
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