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雙熒光素酶報(bào)告基因檢測 實(shí)驗(yàn)常見問題與解答

來源:北京蘭博利德商貿(mào)有限公司   2025年07月21日 09:29  

在分子生物學(xué)研究中,雙熒光素酶報(bào)告基因檢測實(shí)驗(yàn)因其高靈敏度、操作便捷和結(jié)果可靠,被廣泛應(yīng)用于啟動子活性分析、miRNA靶基因驗(yàn)證、轉(zhuǎn)錄因子功能研究等領(lǐng)域。然而,實(shí)驗(yàn)過程中常常會遇到各種問題,例如熒光值異常、重復(fù)性差等,這些問題可能會影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。為了幫助大家更好地掌握這一技術(shù),我們整理了雙熒光素酶報(bào)告基因檢測實(shí)驗(yàn)中的常見問題與解答,涵蓋了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、操作細(xì)節(jié)、數(shù)據(jù)分析等多個(gè)方面,希望這些內(nèi)容助您輕松搞定實(shí)驗(yàn)!


Q1:雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)可應(yīng)用于哪些研究方向?

A1:①驗(yàn)證microRNA同mRNA靶向互作;②驗(yàn)證microRNA同lncRNA/circRNA靶向互作;③驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子與啟動子互作;④啟動子結(jié)構(gòu)分析⑤啟動子SNP分析


Q2:如何選擇報(bào)告基因載體?

A2:螢火蟲熒光素酶基因和海腎基因(內(nèi)參)在同一個(gè)載體上,選擇pmirGLO等載體;螢火蟲熒光素酶基因和海腎基因(內(nèi)參)分別在一個(gè)載體上,可選擇pGL3/pRL系列載體;載體詳細(xì)信息可參考【干貨分享】手把手教你做雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)


Q3:如何選擇主報(bào)告基因和內(nèi)參基因的質(zhì)粒比例?

A3:通常,主報(bào)告基因質(zhì)粒與內(nèi)參質(zhì)粒的比例,建議作一個(gè)預(yù)實(shí)驗(yàn)來調(diào)整(如螢火蟲載體與海腎載體比例分別用1:10、1:20、1:50、1:100)確保內(nèi)參基因被準(zhǔn)確檢測且不干擾主報(bào)告基因的表達(dá)。


Q4:如何保證檢測數(shù)據(jù)的有效性和真實(shí)性?

A4:①設(shè)立對照和重復(fù):實(shí)驗(yàn)中應(yīng)設(shè)立陽性和陰性對照,以驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的有效性且需要做3個(gè)或3個(gè)以上復(fù)孔,并且引入另一個(gè)報(bào)告基因作為內(nèi)參,主要是同批次樣品檢測值也可能出現(xiàn)浮動,排除多種干擾因素的影響(細(xì)胞狀態(tài)、轉(zhuǎn)染效率、載體質(zhì)量、裂解速度、加樣精準(zhǔn)度等)。②熒光值控制:熒光值過高可能會超出儀器的檢測范圍,導(dǎo)致無法檢測到值,一般建議將熒光值控制在5-6位之間。


Q5:熒光值過高或過低怎么辦?

A5:熒光值過高:可減少質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量,或?qū)α呀猱a(chǎn)物進(jìn)行稀釋后檢測;熒光值過低:可能是轉(zhuǎn)染效率低或裂解不充分,建議優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件、增加細(xì)胞量或延長裂解時(shí)間。


Q6:復(fù)孔間重復(fù)性差如何解決?

A6:確保樣本均一性,裂解后離心取上清檢測;定期校準(zhǔn)移液器,保證加樣準(zhǔn)確性;轉(zhuǎn)染時(shí)混合的力度/細(xì)胞量/時(shí)間等保持一致(同個(gè)數(shù)量級內(nèi)的差異是可以接受的)。


Q7:雙熒光素酶檢測需要使用什么檢測板?

A7:建議使用全白板,優(yōu)勢是靈敏度最高而且孔間相互干擾最小。


Q8:雙熒光素酶檢測需要使用什么儀器?

A8: 化學(xué)發(fā)光儀或帶化學(xué)發(fā)光檢測模塊的酶標(biāo)儀。


Q9:海腎和螢火蟲是在同一個(gè)孔里面檢測嗎?能否分開檢測?

A9:同一個(gè)孔里檢測,不會相互影響,蘭博利德的海腎熒光素酶底物中有淬滅螢火蟲熒光值的物質(zhì)??梢苑珠_檢測,但是在一個(gè)孔里檢測會更加準(zhǔn)確。


Q10:實(shí)驗(yàn)過程有哪些注意事項(xiàng)?

A10:①樣品混勻:保證裂解產(chǎn)物與底物快速混合、混合時(shí)間一致,避免熒光素酶衰變的影響。細(xì)胞裂解產(chǎn)物處理:細(xì)胞裂解產(chǎn)物常溫不超過6小時(shí);-20℃一個(gè)月;-80℃半年。    反應(yīng)體系:雙熒光素酶反應(yīng)體系:20?μl(細(xì)胞裂解產(chǎn)物)、100?μl(螢火蟲熒光素酶底物)、100?μl(海腎熒光素酶底物),底物量可根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整,但一定要保證底物過量,不然會造成檢測結(jié)果出現(xiàn)大的偏差。

 

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