Laminar shear stress alleviates monocyte adhesion and atherosclerosis development via miR-29b-3p/CX3CL1 axis regulation

Keywords: Laminar shear stress, Atherosclerosis, CX3CL1, Monocyte adhesion, MiR-29b-3p

流體剪切應(yīng)力是血流作用于血管內(nèi)皮的摩擦力，血管內(nèi)皮細(xì)胞能將其變化轉(zhuǎn)化為生物信號(hào)，調(diào)節(jié)生理過(guò)程。血流狀態(tài)決定剪切應(yīng)力形式，直行血管產(chǎn)生層流剪切應(yīng)力（Lss），血管分支、分叉或彎曲處則出現(xiàn)振蕩或湍流。大量研究表明，直行血管 AS 發(fā)病率低，分叉和彎曲處發(fā)病率高，意味著 Lss 具有重要抗 AS 作用。

CX3CL1 作為由 373 個(gè)氨基酸組成的 CX3C 趨化因子家族成員，以分泌型和膜結(jié)合型兩種形式存在，兼具趨化因子和黏附分子雙重功能，與神經(jīng)系統(tǒng)疾病、骨代謝疾病和心血管疾病等多種系統(tǒng)性疾病相關(guān)，其可介導(dǎo)單核細(xì)胞遷移黏附，促使單核細(xì)胞募集至血管壁破壞內(nèi)皮細(xì)胞功能并誘導(dǎo) AS 斑塊形成。而低剪切應(yīng)力會(huì)激活 CX3CL1 誘導(dǎo)單核細(xì)胞黏附于激活的內(nèi)皮細(xì)胞，Lss 則能降低 CX3CL1 表達(dá)以抑制 AS 進(jìn)展。miRNAs 可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、分化等多種生物過(guò)程在疾病發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用，且 Lss 能通過(guò)調(diào)控 miRNAs 維持內(nèi)皮細(xì)胞功能穩(wěn)定來(lái)發(fā)揮抗 AS 作用。

基于此，吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人獸共患病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的研究團(tuán)隊(duì)結(jié)合生物信息學(xué)和分子生物學(xué)等方法，對(duì) Lss 敏感的 miR - 29b - 3p/CX3CL1 軸在體內(nèi)和體外對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞炎癥及 AS 發(fā)生發(fā)展的影響進(jìn)行探究。研究成果發(fā)表在 Journal of cell science 期刊題為“Laminar shear stress alleviates monocyte adhesion and atherosclerosis development via miR-29b-3p/CX3CL1 axis regulation”。

首先，為了鑒定人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中 Lss 敏感的 mRNA，研究對(duì)靜態(tài)和 Lss 處理的 HAECs、HUVECs 進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，通過(guò) edgR 軟件篩選出差異表達(dá) mRNA。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與靜態(tài)組相比，Lss 組中 452 個(gè) mRNA 表達(dá)顯著改變（圖 1A），其中 297 個(gè)上調(diào)、155 個(gè)下調(diào)（圖 1C）。此外，通過(guò)分析高通量測(cè)序數(shù)據(jù)，對(duì)比HUVECs - 靜態(tài)組與 HUVECs-Lss 組，發(fā)現(xiàn) Lss 組中 1349 個(gè) mRNA 表達(dá)顯著改變（圖 1B），其中 496 個(gè)上調(diào)、853 個(gè)下調(diào)（圖 1D）。為探究 Lss 對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響，研究發(fā)現(xiàn)在 Lss 處理的 HAECs 和 HUVECs 中均下調(diào)的 25 個(gè) mRNA 作為關(guān)鍵 mRNA（圖 1E；表 1）， 其富集的 GO 功能和 KEGG 通路與 AS 發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)（圖 1F-J）， 構(gòu)建的 PPI 網(wǎng)絡(luò)包含 21 個(gè)節(jié)點(diǎn)和 36 條邊（圖 1K,L）。研究表明，CXCR4、APLN、CX3CL1、CSF1 和 HES1 參與 AS 發(fā)生發(fā)展。通過(guò) qRT-PCR 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Lss 處理的 HAECs 中 CX3CL1、CSF1 和 HES1 的 mRNA 表達(dá)降低（圖 1M），其中 CX3CL1顯著下調(diào)，且在 HUVECs 中也得到驗(yàn)證（圖 1N）。同時(shí) HAECs-Lss 組的細(xì)胞上清液和細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)量均較靜態(tài)組降低（圖 1O-Q）。上述結(jié)果表明，Lss 可降低內(nèi)皮細(xì)胞中 CX3CL1 的 mRNA 和蛋白表達(dá)，證實(shí) CX3CL1 是 Lss 敏感基因。

圖1   在低切應(yīng)力條件下，內(nèi)皮細(xì)胞的 CX3CL1 表達(dá)下調(diào)。

表 1   在低切應(yīng)力條件下，GSE103672 數(shù)據(jù)集中 HAECs 和 HUVECs 中均下調(diào)的 mRNA。

為了探究 CX3CL1 對(duì)人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（HAECs）生物學(xué)功能的影響，研究通過(guò)轉(zhuǎn)染RNA（shRNAs）構(gòu)建了 CX3CL1 敲低的細(xì)胞模型。結(jié)果顯示 sh-CX3CL1-1 的敲低效率高（圖 2A ），故選取其用于后續(xù)研究，而 sh-CX3CL1-3 轉(zhuǎn)染后 CX3CL1 表達(dá)量急劇增加的原因尚不明確。 研究表明，內(nèi)皮細(xì)胞 CX3CL1 可誘導(dǎo)單核細(xì)胞黏附并損害血管內(nèi)皮功能。qRT-PCR 和 western blotting 顯示，TNF-α 能誘導(dǎo) HAECs 中 CX3CL1、VCAM-1 和 ICAM-1 的 mRNA 及蛋白表達(dá)升高，而轉(zhuǎn)染 sh-CX3CL1-1 可抑制這些分子的表達(dá)（圖 2B-D）。同時(shí) CX3CL1 表達(dá)降低會(huì)抑制 TNF-α 刺激的單核細(xì)胞黏附增強(qiáng)（圖 2E-F）。

接著，為了探究 Lss 是否通過(guò)調(diào)控 CX3CL1 影響內(nèi)皮細(xì)胞功能，研究構(gòu)建了 CX3CL1 過(guò)表達(dá) HAECs 模型（圖 2G）。結(jié)果顯示 Lss 可顯著抑制 TNF-α 刺激引起的 CX3CL1、VCAM-1 和 ICAM-1 表達(dá)升高，而 CX3CL1 過(guò)表達(dá)則逆轉(zhuǎn)了 Lss 的這一抑制作用（圖 2H-J）。且單核細(xì)胞黏附分析表明，CX3CL1 過(guò)表達(dá)部分逆轉(zhuǎn)了 Lss 對(duì) TNF-α 刺激的單核細(xì)胞黏附增強(qiáng)的抑制效應(yīng)（圖 2K-L）。這些結(jié)果表明， Lss 通過(guò)抑制 CX3CL1 表達(dá)來(lái)減弱單核細(xì)胞對(duì)激活的 HAECs 的黏附。

圖 2    低切應(yīng)力通過(guò)抑制 CX3CL1 的表達(dá)，損害單核細(xì)胞與激活的 HAECs的黏附。

miRNA 表達(dá)對(duì)流體剪切應(yīng)力敏感，且受其調(diào)控的 miRNA 是心血管疾病治療潛在靶點(diǎn)，為了分析 Lss 保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞功能的分子機(jī)制，研究對(duì)響應(yīng) Lss 調(diào)控 CX3CL1 表達(dá)的上游 miRNA進(jìn)行研究。研究通過(guò)借助 TargetScan 和 DIANA TOOLS 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)到 miR-424-5p、miR-497-5p、miR-29c-3p、miR-29a-3p 和 miR-29b-3p 這 5 個(gè)與 CX3CL1 存在保守結(jié)合位點(diǎn)的上游 miRNA（圖 3A，表 2）。qRT-PCR 顯示 Lss 處理后 miR-29b-3p 表達(dá)上調(diào)顯著（圖 3B）。為進(jìn)一步證實(shí) miR-29b-3p 與 CX3CL1 的相互作用 ，研究構(gòu)建 CX3CL1-3′UTR 野生型和突變型的熒光素酶報(bào)告基因載體，以及 miR-29b-3p 模擬物和陰性對(duì)照。結(jié)果顯示 miR-29b-3p 過(guò)表達(dá)顯著抑制野生型載體的熒光素酶活性，突變型則無(wú)此效果（圖 3D）。在 HAECs 中構(gòu)建的 miR-29b-3p 過(guò)表達(dá)或敲低模型后，miR-29b-3p 的表達(dá)相應(yīng)地上調(diào)或下調(diào)，表明成功構(gòu)建了 miR-29b-3p 過(guò)表達(dá)或敲低的細(xì)胞模型（圖 3E，I）。進(jìn)一步驗(yàn)證顯示，miR-29b-3p 的過(guò)表達(dá)抑制了 CX3CL1 的 mRNA 和蛋白表達(dá)，而 miR-29b-3p 的敲低則促進(jìn)了 CX3CL1 的 mRNA 和蛋白表達(dá)（圖 3F-H，J-L）。上述結(jié)果證實(shí) CX3CL1 是 miR-29b-3p 的直接靶基因。

圖 3   CX3CL1 是 miR-29b-3p 的直接靶基因。

表 2   利用 TargetScan 和 DIANA TOOLS 預(yù)測(cè)的可能結(jié)合 CX3CL1 的 miRNAs。

如圖 4A 所示，TNF-α 可誘導(dǎo) HAECs 中 miR-29b-3p 表達(dá)下調(diào)，而轉(zhuǎn)染 pri-miR-29b-3p 可恢復(fù) miR-29b-3p 的表達(dá)，表明在 TNF-α 激活的 HAECs 中成功實(shí)現(xiàn)了 miR-29b-3p 的過(guò)表達(dá)。接下來(lái)，對(duì)miR-29b-3p 是否在 TNF-α 激活的 HAECs 中調(diào)控 CX3CL1 的表達(dá)進(jìn)行了研究。qRT-PCR 和 western blotting 結(jié)果顯示，miR-29b-3p 過(guò)表達(dá)能顯著抑制 TNF-α 誘導(dǎo)的 CX3CL1、VCAM-1和ICAM-1的 mRNA 及蛋白表達(dá)升高，并抑制單核細(xì)胞黏附增強(qiáng)（圖 4B-I）。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證 miR-29b-3p 是否通過(guò)調(diào)控 CX3CL1 抑制單核細(xì)胞黏附，將 pri-miR-29b-3p 與 pri-CX3CL1 共轉(zhuǎn)染至 TNF-α 激活的 HAECs 中。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在 TNF-α 激活的 HAECs 中 ，CX3CL1 過(guò)表達(dá)可消除 miR-29b-3p 對(duì) CX3CL1、VCAM-1、ICAM-1 表達(dá)及單核細(xì)胞黏附的抑制作用（4J-N）。此外，在施加 Lss 條件下，敲低 miR-29b-3p 可逆轉(zhuǎn) Lss 對(duì) TNF-α 誘導(dǎo)的 CX3CL1、VCAM-1、ICAM-1 表達(dá)及單核細(xì)胞黏附的抑制效應(yīng)（圖 4R,S）。綜上，研究證實(shí) Lss 通過(guò)調(diào)控 miR-29b-3p/CX3CL1 軸，抑制 CX3CL1 及其下游黏附分子表達(dá)，從而減弱單核細(xì)胞對(duì)激活的 HAECs 的黏附。

圖 4   低切應(yīng)力通過(guò)調(diào)控 miR-29b-3p/CX3CL1 軸損害單核細(xì)胞與激活的 HAECs 的黏附。

NF-κB 信號(hào)通路在炎癥調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用，已有研究表明內(nèi)皮 miRNA 可通過(guò)調(diào)節(jié)該通路影響單核細(xì)胞黏附。為了明確 Lss 敏感的miR-29b-3p/CX3CL1 軸調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞黏附的分子機(jī)制，研究分析了其對(duì) TNF-α 激活的HAECs 中NF-κB 信號(hào)通路的影響。實(shí)驗(yàn)顯示，Lss 能抑制 TNF-α 誘導(dǎo)的VCAM-1、ICAM-1 上調(diào)，顯著抑制 TNF-α 誘導(dǎo)的 p65 和 IκBα 的磷酸化（圖 5A,B），并且Lss 顯著減少了  p65的積累和核轉(zhuǎn)位（圖 5C-F），表明 Lss 可通過(guò)抑制 NF-κB 信號(hào)激活調(diào)節(jié)內(nèi)皮炎癥。敲低 miR-29b-3p 會(huì)逆轉(zhuǎn) Lss 對(duì) NF-κB 信號(hào)通路的抑制作用（圖 5E）。此外，miR-29b-3p 過(guò)表達(dá)或 CX3CL1 敲低均能顯著抑制 TNF-α 刺激下VCAM-1、ICAM-1 的上調(diào)及 p65、IκBα 磷酸化圖 (5G,H )，減少 p65 核積累與核轉(zhuǎn)位（圖 5I-K）。綜上，Lss 敏感的 miR-29b-3p/CX3CL1 軸通過(guò)阻斷 NF-κB 信號(hào)通路，減輕內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)。

圖5    低切應(yīng)力敏感的 miR-29b-3p/CX3CL1 軸通過(guò)阻斷 HAECs 中的 NF-κB 信號(hào)通路來(lái)緩解炎癥。

最后，為了在體內(nèi)驗(yàn)證 Lss 與 miR-29b-3p、CX3CL1 的關(guān)聯(lián)，研究檢測(cè)了 ApoE?/?小鼠主動(dòng)脈弓（湍流 Oss 作用）和胸降主動(dòng)脈（Lss 作用）內(nèi)膜中相關(guān)分子的表達(dá)，發(fā)現(xiàn) Lss 作用的胸主動(dòng)脈內(nèi)膜中 miR-29b-3p 表達(dá)上調(diào)，CX3CL1 表達(dá)下調(diào)，而主動(dòng)脈弓的結(jié)果與之相反；體外實(shí)驗(yàn)也表明，振蕩剪切應(yīng)力（0.5±4 dyn/cm2） 處理人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（HAECs）會(huì)導(dǎo)致 CX3CL1 表達(dá)上調(diào)、miR-29b-3p 表達(dá)下調(diào)。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證 miR-29b-3p 在體內(nèi)對(duì) AS進(jìn)展的調(diào)控作用，研究將 6 周齡雄性 ApoE?/?小鼠分為正常飲食（ND）組和高脂飲食（HFD）組喂養(yǎng) 4 個(gè)月，最后 1 個(gè)月注射 agomir-miR-29b-3p 或陰性對(duì)照（圖 6A）。結(jié)果顯示，HFD 顯著降低小鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜 miR-29b-3p 表達(dá)，而注射 agomir-miR-29b-3p 可恢復(fù)其表達(dá)（圖 6B） 并抑制 CX3CL1 的 mRNA 和蛋白水平。生化檢測(cè)表明，HFD 導(dǎo)致小鼠血清 HDL-C 降低，TG、TC 和 LDL-C 升高，miR-29b-3p 過(guò)表達(dá)則逆轉(zhuǎn)了這些血脂異常（圖 6C-F）。主動(dòng)脈形態(tài)學(xué)觀察顯示，HFD 組小鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜增厚、斑塊形成，而 miR-29b-3p 過(guò)表達(dá)顯著減小了斑塊面積（圖 6G），油紅 O 染色也證實(shí)miR-29b-3p 過(guò)表達(dá)能部分減輕HFD 誘導(dǎo)的主動(dòng)脈內(nèi)膜脂質(zhì)沉積（圖 6H-I）。上述結(jié)果表明，miR-29b-3p 在體內(nèi)可改善 AS 進(jìn)展。

本研究還探討了miR-29b-3p 是否通過(guò)調(diào)控 CX3CL1 表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié) AS 小鼠的內(nèi)膜炎癥，從而影響 AS 發(fā)展。Western blotting 結(jié)果顯示，miR-29b-3p 過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了 HFD 喂養(yǎng)的 ApoE?/?小鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜中 CX3CL1、VCAM-1 和 ICAM-1 的蛋白表達(dá)升高（圖 6J,K）。免疫組織化學(xué)染色也表明，HFD 組小鼠主動(dòng)脈中 CX3CL1 和 VCAM-1 的表達(dá)顯著增加，而 miR-29b-3p 過(guò)表達(dá)則下調(diào)了其表達(dá)（圖 6L）。綜上，miR-29b-3p 在體內(nèi)通過(guò)抑制 CX3CL1 及其下游黏附分子的表達(dá)，減輕內(nèi)皮細(xì)胞炎癥，進(jìn)而改善 AS。

圖 6   miR-29b-3p 通過(guò)緩解 HFD 誘導(dǎo)的內(nèi)皮炎癥，改善 ApoE?/?小鼠的 AS。

總之，研究揭示了 Lss 敏感的 miR-29b-3p/CX3CL1 軸可顯著抑制單核細(xì)胞對(duì)激活的人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，并減輕高脂飲食喂養(yǎng)的 ApoE?/?小鼠的局部炎癥和斑塊形成。

參考文獻(xiàn)：Pu L, Meng Q, Li S, Wang Y, Sun B, Liu B, Li F. Laminar shear stress alleviates monocyte adhesion and atherosclerosis development via miR-29b-3p/CX3CL1 axis regulation. J Cell Sci. 2022 Jul 15;135(14):jcs259696. doi: 10.1242/jcs.259696. Epub 2022 Jul 22. PMID: 35735031; PMCID: PMC9450891.

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